Евгений Касперский родился в 1965 году, был единственным ребёнком в семье. Начал обучение в средней школе № 3 имени Гастелло в подмосковном городе Долгопрудный. Ещё в школе Касперский начал углубленное изучение математики в рамках спецкурса. После победы в математической олимпиаде в 1980 году был зачислен в физико-математическую школу, где продолжил углубленное изучение этих предметов, и в 1982 году окончил физико-математическую школу-интернат № 18 имени А. Н. Колмогорова при МГУ.
В 1987 году окончил 4-й (технический) факультет Высшей школы КГБ (в настоящее время факультет известен как Институт криптографии, связи и информатики Академии ФСБ России) в Москве, где изучал математику, криптографию и компьютерные технологии, и получил специальность «инженер-математик».
В 1991 году Евгений Касперский начал работать в Центре информационных технологий КАМИ, где возглавил небольшую группу специалистов, занимавшуюся разработкой антивирусных решений.
В ноябре 1992 года группа выпустила свой первый полноценный продукт — AVP 1.0. В 1994 году он одержал победу в сравнительном тестировании, проведенном тестовой лабораторией Гамбургского университета. Это обеспечило продукту международную известность, и разработчики начали лицензировать свои технологии зарубежным IT-компаниям.
В 1997 году Касперский и его коллеги приняли решение создать собственную компанию, выступив в качестве соучредителей «Лаборатории Касперского». Евгений не хотел, чтобы в названии компании фигурировала его фамилия, но его переубедила Наталья Касперская — жена Евгения на тот момент, также вошедшая в число соучредителей Лаборатории. В ноябре 2000 года продукт AVP был переименован в Антивирус Касперского.
Касперский руководил антивирусными исследованиями в компании со дня её основания по 2007 г., когда он занял пост генерального директора «Лаборатории Касперского».
Офис Касперского находится в новом бизнес-центре на Ленинградском шоссе. Рабочий кабинет Евгения Касперского находится на одном этаже с ведущими разработчиками и аналитиками компании, рядом с Глобальным центром исследований «Лаборатории Касперского» (GReAT). Евгений является соавтором нескольких патентов в сфере информационной безопасности, в том числе патента на ограничительно-атрибутную систему безопасности, контролирующую взаимодействие компонентов ПО. Этот патент выдан на технологию, лежащую в основе разрабатываемой в настоящее время «Лабораторией Касперского» безопасной операционной системы.
На сегодняшний день Касперский — один из ведущих мировых специалистов в области защиты от вирусов. Он является автором большого числа статей и обзоров по проблеме компьютерной вирусологии, регулярно выступает на специализированных семинарах и конференциях в России и за рубежом. Касперский — член Организации исследователей компьютерных вирусов (CARO), которая объединяет экспертов в этой области.
Касперский является основателем конференции Virus Bulletin, которая с 2001 года ежегодно проводится в антивирусной индустрии.
В 2012 году Касперский вошёл в рейтинг 100 самых влиятельных мыслителей года по версии журнала Foreign Policy.
В декабре 2012 года американский журнал Wired поместил Касперского на 8-е место в списке из 15-ти самых опасных людей в мире. Этого места Касперский был удостоен за разоблачение американского кибероружия, созданного для шпионажа на Ближнем Востоке и срыва иранской ядерной программы.
Евгений ощущает себя человеком, который находится на передовой линии фронта в войне с киберпреступниками. «Лаборатория», по утверждениям Касперского, инвесторов не имеет, действует исключительно за счёт собственных ресурсов, всю прибыль вкладывает в дальнейшее развитие.